Enzymsubstrate \ FRETS Peptidbibliotheken (21)
Jedes Substrat (Code 3701-v – Code 3719-v) der FRETS-25Xaa-Serie enthält eine hochfluoreszierende 2-(N-Methylamino)benzoyl (Nma)-Gruppe, die an die Seitenkette des Aminoterminalen D-2,3-Diaminopropionsäure (D-A2pr)-Restes gebunden ist und durch eine 2,4-Dinitrophenyl (Dnp)-Gruppe, die an die Funktion von Lysin gebunden ist, effizient gelöscht wird. Xaa steht für eine feste Position jeder der 19 natürlichen Aminosäuren, ausgenommen Cys (im Produktnamen Code 3701-v – Code 3719-v angegeben). Eine Mischung aus 5 Aminosäureresten (P, Y, K, I und D) befindet sich an der Yaa-Position zusammen mit einer Mischung aus 5 Aminosäureresten (F, A, V, E und R) an der Zaa-Position für jedes feste Xaa. Dies ergibt eine Peptidmischung von 25 Kombinationen jeder Xaa-Serie, was zu einer kombinatorischen Bibliothek von insgesamt 475 Peptidsubstraten führt. Sowohl Nma- als auch Dnp-Gruppen sind an die Seitenkette der einzelnen Reste gebunden, was die Bestimmung der Spaltstelle durch ein spezifisches Enzym mittels massenspektrometrischer Analyse und Edman-Abbau ermöglicht. Die enzymatische Reaktion sollte durch die Verwendung eines geeigneten Inhibitors ( Leupeptin , E-64 oder Pepstatin A ) beendet werden. Wir haben bestätigt, dass die FRETS-25Xaa-Serie effektiv für den Assay zahlreicher Proteasen wie Trypsin, Chymotrypsin, Elastase, Thrombin, Papain, Calpain, Pepsin und Thermolysin verwendet werden kann. Sie funktionierten jedoch nicht gut für den Assay von Caspase-3, wahrscheinlich weil sie in jedem Substrat nur drei veränderbare Stellen (Zaa-Yaa-Xaa) haben (Defizit der P4-Stelle). Diese Tatsache deutet darauf hin, dass FRETS-25Xaa möglicherweise nicht für den Assay eines Enzyms mit einem breiten Spektrum an Wechselwirkungsstellen mit dem Substrat anwendbar ist.
